近日，华南师范大学环境学院应光国教授团队高方舟博士等人有关河流微生物组的最新研究发表在环境领域期刊Water Research。
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引言
河流是地球上最重要的生态系统之一，在促进文明、调节气候动态和保护生物多样性方面发挥着关键作用。河流微生物对地球化学循环和污染物修复具有重要影响。高通量测序的发展为河流微生物组研究提供了线索，产生了大量有助于阐明微生物暗物质和微生物生态学的环境数据。基于宏基因组学的研究强调，在接收废物输入的河流中，抗生素耐药性和感染性病原体的广泛存在，加剧了不同栖息地类型的公共卫生问题。研究河流微生物组对揭示河流微生物的潜在价值具有重要意义，对于有效的河流管理和健康风险监测至关重要。
将微生物富集在0.22 μm微孔滤膜是研究河流微生物组的常见预处理步骤，大多数宏基因组数据集都来源于此。然而，微生物学家已经揭示了小型微生物的存在，并解读了它们在河流生态系统中的关键生态作用。一个值得注意的例子是Patescibacteria，其特征是基因组较小，预测的生物合成和代谢途径很少，它们在水生和陆地生态系统中被广泛识别，其超小型估计在0.1 µm至0.3 µm之间。因此，这些小型微生物中的很大一部分会逃脱0.22 μm的捕获。另外，不同生长阶段的细胞大小使过滤程序的效果更复杂：尽管微生物多样性可能受到的影响较小，但仅对较大的细胞进行测序可能会导致遗传多样性的丧失。病毒组研究可能受此方法的影响最大。研究水生病毒组有两种主要的研究范式：1）测序前的病毒富集，2）从宏基因组数据集中提取病毒基因组。后一种方法因其广泛的研究价值和易于实施而在大尺度环境调查中受到青睐。然而，游离病毒的极小型，以及那些整合或吸附到小宿主细胞上的病毒，导致它们在0.22 μm过滤过程中有所损失。综上，使用0.22 μm孔径富集微生物可能会忽视具有重要价值的小型微生物组，但目前尚不清楚这种方法究竟损失多少。
研究方法
本研究以湘江流域为例，揭示河流中被低估的小型微生物组。我们分别在雨季和旱季采集河水样本，每份样品依次通过0.22 μm（大型）和0.1 μm（小型）孔径的膜进行过滤，滤液作为胞外部分。我们检测了大型、小型和胞外DNA的浓度，以分析每个组分中的微生物组丰度，随后进行了宏基因组测序，利用生物信息学方法阐明大型、小型微生物组之间的差异，重点关注微生物群落于功能、病毒群落、抗生素耐药性和基因组组装等方面。
主要结果
1. 小型微生物组的浓度比大型微生物组低大约两个数量级，微生物群落组成不同，且多样性较低。大型组的DNA浓度范围为1.7 ng/mL至35.3 ng/mL，比小型组和胞外组高出约两个数量级（图1）。小型组的浓度范围更广，一些河段的浓度达到了大型组的水平。旱季DNA的浓度低于雨季，这可能与水温有关。河流中共检测到87门2616属，两组共有1488属，特有属的丰度极低。大型组比小型组具有更高的微生物多样性，但微生物网络复杂性较低。在两组中，变形菌门和放线菌门都是主要的门，占微生物丰度的70.9%至99.3%。15个门在大型组中的丰度更高，4个门在小型组的丰度更高。在物种水平上，两组中共有2710个特有物种。其中一些属于Proteobacteria、Planctomycetota和Chloroflexota的物种在大型组中占主导地位，而一些属于Patescibacteria、Spirochaetota、Elusimicrobiota、Desulfobacterota_I和Firmicutes_C的物种在小型组中占优势。
图1.大型组和小型组之间微生物群落的变化。（a）本研究的采样图。（b）每组中DNA的绝对丰度。（c）属水平的微生物多样性。（d）NMDS分析。（e）丰度最高的20个门。（f-g）小型或大型组中特有类群的枝序图。
2. 小型微生物组比大型微生物组富集了更多的病毒序列。小型组共检测到21646个vOTU，明显多于大型组（9204个vOTUs；图2）。共享vOTU占小型组vOTU的14.7%，占大型组vOTUs的38.7%，共享vOTU的总丰度低于特有vOTU的总丰度。组间和季节间病毒群落存在明显差异。88.9%的vOTU被鉴定为Duplodnaviria的Caudoviricetes，大部分vOTU未被鉴定为更低的分类地位。约90.0%的vOTU被分配了生活型，其中70.0%的vOTU属于裂解性病毒，其丰度显著高于温和性病毒。
图2.大型组和小型组之间病毒群落的变化。（a）vOTU的数量。（b）NMDS分析。（c）病毒分类。（d）两种生活方式中vOTU数量。（e）小型组中病毒序列携带的功能。（f）携带ARGs、VFGs和BMRGs的病毒数量。（g）仅在小型组中检出的病毒的宿主。
3. 小型微生物组与大型微生物组具有不同的抗生素耐药风险。在河流中共检测到1087种ARG亚型，属于29种ARG类型（图3）。大型组总抗性组的绝对丰度显著高于小型组，但两组之间的相对丰度没有显著差异，小型组在某些河段的相对丰度明显更高。两组的抗性组的组成不同，小型组的组内差异较大。大型组检测到的ARG亚型数量多于小型组，其中两组共有364种亚型，仅在小型组中检测到的ARG亚型有140种。95个亚型的相对丰度存在组间差异，其中61个亚型在小型组中更为丰富。所有样品中共检出86种I类风险的ARG亚型，其中emrB、mdtE、mdtL、pmrF和tolC在小型组中富集。另外，8种ARG大类在小型组富集，而5种大类在大型组中富集。
图3.大型组和小型组之间抗性组的差异。（a）总抗性组的绝对丰度。（B）总抗性组的相对丰度。（c）NMDS分析。（d）ARG亚型的稀释曲线。（e）每组中共有和特有ARG亚型数量。（f）小型组特有ARG亚型的检出频率和丰度。（g）两组ARG亚型的差异分析。带有标签的点是I类风险ARG亚型。（h）所有样本中前15种富集ARG大类的比例。
4. 几种具有不同生态功能的抗生素抗性病原菌仅在小型微生物组中发现。从所有样本中总共组装了371个MAGs，大型组的数量是小型组的两倍，其中21个接近完整的基因组中有17个来自小型组。两组共有167个物种水平MAGs，其中60个MAGs的物种同时在同一河段的两组中检测到。MAGs被鉴定为12门57科。值得注意的是，Patescibacteria仅在小型组中获得，而Planctomycetota仅在大型组中获得。有114个MAGs至少携带一种ARGs、BMRGs或VFGs，这些MAGs主要属于Proteobacteria的Burkholderiaceae、Enterobacteriaceae和Moraxellaceae。大多数ARGs只存在于一个MAG或一个科宿主，而另一些ARGs由几个科或门宿主携带。Klebsiella grimontii和Acinetobacter pittii是最值得关注的物种，与其他细菌相比，它们携带的ARGs、BMRGs和VFGs最多，它们都是在小型组中获得的。此外，仅在小型组中获得的物种还有Acinetobacter johnsonii、Pseudomonas_B oryzihabitans和Pseudomonas_E sediminis，它们均携带多种ARGs、BMRGs和VFGs。除了抗性和致病性外，以上物种还具有丰富的地球化学循环功能，其中K. grimontii具有最多样化的功能基因。在污染物降解方面，所有物种都检测到了碳氢化合物和持久性有机污染物降解基因，但它们的能力不同，而塑料降解基因仅在A. johnsonii和P. sediminis中发现。
图4.宏基因组组装基因组（MAG）在大型组和小型组中的组成。（a）MAG的质量分布。（b）MAGs的基因组信息、系统发育和分类。（c）MAG在物种水平上的聚类。（d）仅在小型组中检出的关键物种的基因组功能特征。
结论
本研究中，我们对河流生态系统中的小型和大型微生物组进行了比较研究。尽管DNA生物量较低，但小型含有许多独特的细菌种类，病毒序列是大型的两倍。小型微生物组还存在ARGs类型和I类风险ARG亚型的富集，以及特有ARG亚型检出情况，同时还可以获得五种关键耐药病原体基因组信息。总体而言，仅对大型微生物组进行测序将丢失河流生态系统的重要微生物组信息。未来的研究应引入新的预处理策略和微生物实验方法，将小型微生物组纳入河流生态系统研究。
致谢
本研究得到国家自然科学基金（U22A20604、42030703、42307359和42107022）、华南师范大学青年教师科研培育基金和广东省普通高校青年创新人才项目的支持。同时感谢参与野外采样的团队成员。
全文引用：Gao FZ, Hu LX, Liu YS, Qiao LK, Chen ZY, Su JQ, He LY, Bai H, Zhu YG, Ying GG. Unveiling the overlooked small-sized microbiome in river ecosystems. Water Research 2024, 265, 122302.